大豆分离蛋白（SPI）因其营养价值丰富、生产所带来的成本低、功能特性齐全而被大范围的应用于食品加工行业。SPI由脱脂豆粕加工而成，其蛋白质量分数在90%以上（干基）。glycinin和β-conglycinin是SPI的主要组分，占蛋白含量的60%～70%。

　　SPI通常由碱提（pH 7～9）酸沉（pH 4.5～4.8）法制备。在调节粗蛋白溶液pH值过程中会产生一定浓度的NaCl，浓度受操作影响。获得的分离蛋白悬浊液经喷雾干燥制备成SPI粉。可见，pH值、NaCl浓度和温度等是SPI生产的全部过程中蛋白质聚集程度的重要调控因素。

　　蛋白质聚集程度是影响蛋白质功能性的主要的因素。依据聚集程度不同，SPI聚集体可分为可溶性聚集体和不可溶性聚集体，不可溶性聚集体是由可溶性聚集体进一步聚集而成。蛋白质发生聚集后颗粒尺寸增加，蛋白质凝胶强度和乳化能力增加，起泡能力和溶解性下降，反之则反。

　　中国农业科学院农产品加工研究所的孟昂、栾滨羽、张波*等从相互作用、耐热性、聚集程度及胶凝特性等综述了pH值、NaCl和温度对SPI及其组分glycinin和 β -conglycinin的变性、聚集和流变特性的影响，阐明了其内在可能的机制；梳理了蛋白质聚集度、凝胶链粗厚度、凝胶链曲直率、凝胶网络连续性与凝胶强度的关系；总结了pH值、NaCl和温度对蛋白质聚集影响的差异。旨在为通过制备参数调控SPI聚集程度提供帮助。

　　SPI及其组分等电点在酸性环境中，因此SPI及其组分是一种酸性蛋白质。在pH 7～9的中碱性环境中，SPI及其组分侧链氨基以—NH 2 的形式存在，羧基去质子化以—COO - 的形式存在，故Zeta电位为负值；随pH值的降低，溶液中H + 含量逐渐增加，SPI及其组分侧链氨基质子化以—NH 3+ 的形式存在，羧基继续以—COO - 的形式存在，故在pH 4～6的等电区，蛋白质表面净电荷接近零，分子间斥力最小；随pH值下降到3～4的酸性环境时，SPI及其组分侧链氨基继续以—NH 3+ 的形式存在，羧基发生质子化反应以—COOH的形式存在，因此该环境中Zeta电位为正值。

　　分子间斥力越小，相对而言，相互吸引力越大，蛋白质则更容易聚集。在pH 3～9的环境中，蛋白质之间的相互作用主要由静电斥力和疏水相互作用主导。静电斥力越小，疏水相互作用越大，蛋白质聚集程度越大，颗粒尺寸越大。

　　当蛋白质表面静电斥力增大，疏水相互作用无显著变化时，蛋白质聚集程度下降，聚集体尺寸减小。Tian Yan等通过调整10 mg/mL（0 mol/L NaCl）β-conglycinin溶液的pH值检测蛋白质物化特性的变化，根据结果得出，当溶液pH值为3、5或8时，蛋白质的Zeta电位分别为10.6、-3.5 mV和-10.5 mV，表面疏水性分别为3 131、2 649和2 462，水动力学直径分别为273、2 052 nm和66 nm左右，蛋白质溶解度分别为92.2%、40.3%和96%。蛋白质溶液的pH值从4～6的等电区环境增加到7～9的中碱性环境过程中，蛋白质聚集体平均摩尔质量和颗粒尺寸以不同的聚集方式或聚集速率下降。

　　当分子间静电斥力无显著差异时，疏水相互作用越高，蛋白质聚集程度越大，粒径越大。Tian Yan等报道10 mg/mL的β-conglycinin溶液中，当pH值分别为3和8时，蛋白质的Zeta电位分别为10.6 mV和-10.5 mV，表面疏水性分别为3 131和2 462，水动力学直径分别为273 nm和66 nm左右。

　　分子间斥力和疏水相互作用均无显著变化时，蛋白质聚集程度和粒径亦无显著变化。王中江等研究显示，10 mg/mL的SPI溶液，当pH值从7增加到9，蛋白质表面疏水性从800下降到600左右，溶解度从78%增加到81%左右。

　　利用差示扫描量热仪（DSC）研究蛋白质在pH 3～9范围内热稳定特性。相比于pH 3～4的酸性环境，在pH 4～6的等电区环境和pH 7～9的中碱性环境中，SPI、纯化的β-conglycinin和glycinin的热转变温度及变性焓值均更高，即SPI及其组分在低于等电区的酸性环境中更容易变性。

　　在pH 3～9范围内，β-conglycinin仅有一个吸热峰。当pH值从3.3升高至7.6，质量分数9%～15% β-conglycinin的 T 0 从62～63 ℃升高至71～74 ℃，变性焓值从6 mJ/mg升高至11 mJ/mg。研究表明，随pH值的降低，蛋白质表面电荷分布改变，颗粒间相互排斥增大，蛋白质空间构象从致密状态转变为疏松状态，因此β-conglycinin变性温度和变性焓值均下降，即较高的羧基质子化程度为低pH值条件下β-conglycinin的变性提供了驱动力。

　　基于以上内容，相比于pH 7.6，在pH 3.8时，SPI中β-conglycinin的羧基质子化以及glycinin的半解离或许是其热转变温度向较低温度转移的原因。在pH 3.8条件下，glycinin以11S和7S（T0与β-conglycinin相似）两种形式存在，因此，在pH 3.8条件下，SPI中较低温度下的吸热峰或许是由glycinin-7S与β-conglycinin的变性共同导致的。在pH 7.6时，纯化的glycinin的峰值变性温度比SPI中glycinin的峰值变性温度低5 ℃左右，可能是由于β-conglycinin中β-亚基通过疏水相互用与glycinin的碱性多肽结合，来提升了SPI中glycinin的热稳定性。

　　凝胶化过程通常分为以下几个阶段，即蛋白质分子链展开，分子链间发生相互作用形成蛋白质聚集体，聚集体发生交联反应形成凝胶网络结构。凝胶化温度（T gel ）是指聚集体发生交联形成凝胶网络结构时的温度，定义为凝胶储存模量增速超过0.5 Pa/K对应的温度。Renkema等通过动态流变测定SPI的 T gel ，结果显示，当pH值为3.8和5.2时，100～120 mg/mL（0.2 mol/L NaCl）SPI的 T gel 分别为65 ℃和70 ℃左右，与β-conglycinin的 T 0 一致；当pH值为7.8时， T gel 为90 ℃左右，与glycinin的 T 0 一致。可见，对于SPI，在pH 3～4酸性环境和pH 4～6等电区环境中，蛋白质的 T gel 与其组分β-conglycinin的 T 0 一致，而在pH 7～9的中碱性环境中，蛋白质的 T gel 与glycinin的 T 0 一致。

　　通过以上内容能得出，无论酸性环境还是中碱性环境，SPI凝胶的形成是由β-conglycinin和glycinin共同变性导致的。当SPI中glycinin含量较高时，蛋白质热转变温度和 T gel 均较高，有研究表明，当glycinin与β-conglycinin质量比从3∶1转变为1∶3，蛋白质的 T gel 从76 ℃降低至64 ℃。

　　蛋白质聚集程度越大，聚集体尺寸越大，凝胶形成速率越快，凝胶储能模量（G’）越高。有研究表明，随溶液pH值从6.8降低至5.8，95 mg/mL的SPI的凝胶化速率增加20 倍左右。相比于pH 7～9的中碱性环境，在pH 3～4的酸性环境中，蛋白质聚集体尺寸更大，在形成凝胶时会具有更加粗厚的凝胶链，因此蛋白质凝胶G’更高。

　　研究表明，β-conglycinin和glycinin的主要成分是β链（β-strands）结构，随pH值的下降或热处理，β-strands会暴露在分子表面，且暴露程度逐渐增大，从而促使蛋白质聚集，尺寸变大，其凝胶G’也随之增大，即β-strands的暴露程度与凝胶G’呈正相关。

　　根据蛋白质在凝胶网络中的分布不同，分为构成凝胶网络骨架的网络蛋白质和未参与凝胶网络骨架分布在凝胶基质中的非网络蛋白质。凝胶G’大小还与网络蛋白数量和网络结构有关。对于SPI、纯化的β-conglycinin和glycinin，如果在凝胶体系中可溶性蛋白（非网络蛋白）含量越高，则凝胶G’值越低。可溶的蛋白质位于网络的孔隙中，不会对凝胶的硬度产生一定的影响。相比较于pH 7～9的中碱性环境，在pH 3～4的酸性环境中蛋白质凝胶网络的蛋白含量更高。

　　在凝胶网络结构中，如果形成的凝胶网络链越直，则凝胶G’越高。相比于pH 3～4的酸性环境中，在pH 7～9的中碱性环境中，蛋白质凝胶网络链较弯曲。蛋白质浓度与凝胶G’的比值（X）表示形成单位凝胶G’需要的蛋白质浓度，可拿来描述凝胶网络链的粗细，X值越低，凝胶网络链越粗。该比值还与链的性质α和分形维数Df有关：X＝α/（3-Df）。当α为3左右时，凝胶链可视为曲链，当α为2左右时，凝胶链可视为直链。Lakemond等研究报道，质量分数10%（0.2 mol/L NaCl）的SPI凝胶在pH 3.8条件下，外观呈浑浊、白色且颗粒状，α值为2，Df值为2.1，凝胶网络链粗厚程度较高；在pH 7.6条件下，蛋白凝胶呈浑浊、淡黄色且光滑的外观，α值为3，Df值为2.3，凝胶网络链粗厚程度相对较低。

　　蛋白质总量保持不变时，在pH 3～4酸性环境中，蛋白质颗粒尺寸较大，形成的凝胶网络链较为粗厚，凝胶网格空间总体积较小，凝胶持水能力则较低，而在pH 7～9中碱性环境中，蛋白质颗粒尺寸较小，凝胶网格空间总体积较大，因此凝胶具备比较好的持水性能。通过离心法测定蛋白凝胶持水能力，结果显示，在pH 3.5～3.8条件下，质量分数10%（0.2 mol/L NaCl）的SPI凝胶持水能力为60%左右，在pH 7.6条件下，凝胶持水能力为80%左右。

　　随着NaCl浓度的增加，蛋白质二级结构有序性增加。远紫外圆二色谱显示，0.2 mg/mL的glycinin溶液，当NaCl浓度从0.03 mol/L增加到0.5 mol/L，在pH 7.6的条件下，二级结构中无规卷曲的相对含量从18%下降到17%；在pH 3.5的条件下，无规卷曲的相对含量从38%下降到25%。静电屏蔽作用可能延缓了其他相互作用对蛋白质构象的影响，使得蛋白质构象处于相对来说比较稳定的状态。Sorgentini等发现，1 mg/mL的SPI溶液（pH 7），当NaCl浓度从0 mol/L增加到1 mol/L，蛋白质表面疏水性从163增加到300左右。

　　如图2所示，在高于等电区的溶液环境中，蛋白质颗粒表面带有一定量的净负电荷，由于静电斥力蛋白质聚集程度较低。当加入一定量的NaCl时，带正电的钠离子可通过静电屏蔽效应与带负电的蛋白质颗粒相互作用，减少蛋白质间静电排斥，增加聚集程度。Li Xianghong等探究了NaCl对蛋白质颗粒尺寸的影响，结果显示，质量分数1%的SPI溶液在100 ℃加热15 min，随后调整NaCl浓度从0 mol/L到0.5 mol/L，Zeta电位从-40.65 mV下降到-18.7 mV，回旋半径（R g ）从28.8 nm增加到78 nm，溶液浊度（A 600 nm ）从0.015增加到0.230。

　　在pH 4～6的等电区环境中，蛋白质表面净电荷接近零，聚集程度最大。随NaCl的加入，一些钠离子会吸附在蛋白质表面，蛋白质颗粒间斥力增加，聚集程度下降。Lakemond等报道，在pH 5～6时，0.6 mg/mL glycinin溶液中的NaCl浓度从0.03 mol/L增加到0.2 mol/L和0.5 mol/L时，蛋白质溶解度从0%分别增加到10%和90%左右，通过研究12 mg/mL glycinin溶液中酸性多肽和碱性多肽相对暴露量发现，随NaCl浓度从0.03 mol/L增加到0.2 mol/L和0.5 mol/L，酸性多肽的相对暴露量从350分别增加到400和700，碱性多肽的相对暴露量始终低于100。随NaCl浓度的增加，酸性多肽的暴露量增加或许是glycinin溶解度增加的原因。

　　NaCl浓度在0～2 mol/L范围内，随着NaCl浓度的升高，蛋白质聚集程度增大，再破坏蛋白质有序结构时需要更加多的热能，蛋白质热稳定性增加；当NaCl浓度进一步增加时，即从盐析过度到盐溶阶段，或许解聚后的蛋白质分子间交联程度增加，分子运动能力变弱，蛋白质结构稳定性增加。Lakemond等通过DSC测定不同pH值时NaCl浓度对glycinin（3 mg/mL）热转变特性的影响，发现当NaCl浓度从0.03 mol/L增加到0.5 mol/L时，在pH 7.6的条件下，glycinin的变性温度从78 ℃增加到94 ℃；在pH 5.2时，glycinin的变性温度从58 ℃和88 ℃均增加到96 ℃；在pH 3.8时，glycinin的变性温度从71 ℃和85 ℃均变化到85 ℃。

　　当NaCl存在时，SPI及其组分凝胶形成条件受离子作用力和热能的共同影响。在SPI及其组分凝胶中，随NaCl浓度的增加，网络蛋白含量逐渐增加，凝胶网络链的粗厚度和强度增加。Wu Chao等发现，180 mg/mL SPI的盐溶液在100 ℃加热30 min，当离子浓度从0 mol/L增加到0.25 mol/L，凝胶中的网络蛋白相对含量从86.4%增加到87.2%，凝胶G’从4 000 Pa增加到7 500 Pa。

　　SPI及其组分凝胶强度也受凝胶链缠结点数量与缠结点强度的共同影响。凝胶链缠结点数量多但缠结点强度小意味着凝胶网络链细，凝胶强度也不高；凝胶链缠结点数量少但缠结点强度大意味着虽然凝胶网络链粗，但同时可能会引起凝胶网络连续性变差，凝胶强度同样也不高；仅凝胶链缠结点数量适中和缠结点强度适中且凝胶网络连续性较好时，凝胶强度才会达到较大值。在蛋白质溶液中，随NaCl的加入，凝胶网络链粗厚度增加，凝胶强度增大；当NaCl浓度超过A点（图3）对应的NaCl浓度时，虽然凝胶网络链粗厚度进一步增加，但凝胶网络缠结点数量下降，连续性变差，凝胶G’下降。

　　随NaCl的加入，凝胶网络链粗厚度增加，凝胶互联网空间体积减小，凝胶持水能力变弱；随NaCl浓度进一步增加，凝胶网络连续性下降，断点较多，凝胶持水能力进一步下降。Lakemond等通过测定100 mg/mL（pH 7）的glycinin凝胶持水率发现，当离子强度从0.03增加到0.2和0.5时，凝胶持水能力从100%下降到60%和40%。

　　Lakemond等通过激光扫描共聚焦显微镜观察到，在离子强度为0.03时，100 mg/mL的glycinin凝胶外观相对透明，凝胶网络致密程度较高，凝胶网络链较细腻；在离子强度增加到0.2时，凝胶外观逐渐浑浊，凝胶网络链逐渐变得粗厚；在离子强度增加到0.5时，凝胶外观依旧浑浊，凝胶网络链更加粗厚，网络孔隙变大，但凝胶网络链连续性下降。

　　蛋白质溶液在设定温度加热一段时间后输入体系中的总热能为积温。两体系中相同热能产生于不同的作用温度和作用时间，其影响效果不同。如90 ℃加热40 min和60 ℃加热60 min，积温值均为3 600 ℃·min，但两者对蛋白质构象和形态的改变程度不同。故考察加热效果对蛋白质聚集的影响，应基于作用温度和作用时间的积温。

　　3.1 低于60 ℃及其积温值低于3 600 ℃·min的热处理对SPI及其组分的影响

　　低于60 ℃及其积温值低于3 600 ℃·min的热处理，SPI中glycinin和β-conglycinin组分均未完全变性。但随处理温度的升高，蛋白质变性程度逐渐增大，特别是β-conglycinin趋于完全变性，蛋白质内部疏水基团暴露增加，导致表面疏水性增加。He Zhiyong等利用高效液相色谱法研究热处理对可溶性蛋白分子质量的影响，50 mg/mL的SPI溶液在20、40 ℃和60 ℃各加热60 min，积温值分别为1 200、2 400 ℃·min和3 600 ℃·min，分子质量大于400 kDa的可溶性聚集体的占比从48%增加到63%。

　　3.2 60～100 ℃及其积温值低于5400 ℃·min的热处理对SPI及其组分的影响

　　SPI 及其组分二级结构中β-折叠含量较高，在60～100 ℃范围内，随温度及其积温值的升高，β-折叠含量明显降低，而无规卷曲含量明显地增加，蛋白质二级结构的有序性降低。Nagano等利用傅里叶变换红外光谱仪检测热处理对β-conglycinin（0.2 mg/mL）的二级结构的影响，在60、70 ℃和80 ℃各加热30 min，积温值分别为1 800、2 100 ℃·min和2 400 ℃·min，相比较于加热前样品，β-折叠相对含量从51.8%左右持续下降到22%左右，α-螺旋和无规卷曲相对含量分别从14.7%和33.5%左右持续增加到22%和57%左右。

　　在蛋白质聚集过程中，颗粒比表面积减小，理论上其表面疏水性和游离巯基含量也相应降低，但如果减小的比表面积上蛋白质内部疏水基团和/或游离巯基暴露增加，或者二硫键断裂，则导致蛋白质聚集过程中表面疏水性和游离巯基增加。王健等利用荧光探针ANS和Ellman试剂法检测热处理过程中蛋白质疏水性和游离巯基的变化，20 mg/mL的SPI溶液在60、70、80、90 ℃和100 ℃各加热10 min，积温值分别为600、700、800、900 ℃·min和1 000 ℃·min，相比较于加热前样品，蛋白质表面疏水性从80持续增加到230，游离巯基含量从4 μmol/g持续增加到10.5 μmol/g。

　　据报道，β-conglycinin是由α’亚基、α亚基和β亚基通过疏水相互作用组成的三聚体，其中α’和α亚基由核心区和延伸区组成，含有两个N-连接的高甘露糖聚糖，延伸区具有高度亲水性，因此α’/α亚基具有较高的亲水特性。β亚基仅由核心区组成，含有一个N-连接的高甘露糖聚糖，且富含疏水性氨基酸，因此具有较高的疏水性，如图4a所示。Nobuyuki等报道虽然聚糖和延伸区不会促进分子折叠和组装成三聚体，但在阻止蛋白质的热聚集方面具备极其重大作用。β-conglycinin经热处理后，分子链展开，蛋白质通过疏水相互作用发生聚集，一旦疏水残基被覆盖或埋藏在聚集体的内部，表面的碳水化合物和亲水性基团就会产生较大的排斥力和位阻，抑制其他单体的靠近，聚集就会停，如图5所示。

　　glycinin是由碱性（basic，B）多肽和酸性（acid，A）多肽通过二硫键组成的六聚体。B多肽含有较多不带电氨基酸，如Lys、Arg和His，这些氨基酸均为高度疏水性氨基酸，因此B多肽具有高度疏水性。A多肽通常位于glycinin的表面，且含有较多的亲水性氨基酸，因此A多肽具有较强的亲水性，如图4b所示。蛋白质分子链展开后，虽然部分疏水位点在聚合过程中被覆盖，但是glycinin聚集体中不存在高度亲水性的聚糖，仅靠A多肽提供的排斥屏障似乎不足以阻止其他蛋白质颗粒的接近，因此在加热过程中，蛋白质可继续通过剩余活性位点保持聚集。故在glycinin的热聚集过程中观察到聚集物的快速生长和凝结沉淀，如图5所示。

　　SPI在热处理过程中存在两种聚集方式，一种是随热处理温度的升高，蛋白质间通过疏水相互作用和/或二硫键聚集，蛋白质颗粒摩尔质量和尺寸持续增加。Guo Fengxian等利用尺寸排阻高效液相色谱法检测热处理过程中可溶性蛋白质聚集体分子质量（m）的变化，20 mg/mL的SPI溶液在80、90 ℃和100 ℃各加热15 min，积温值分别为1 200、1 350 ℃·min和1 500 ℃·min，相比较于加热前样品，m大于1 000 kDa可溶性聚集体相对含量从0.3%分别增加到10.1%、17.5%和26.4%。

　　与上述现象相反，在热处理过程中，SPI聚集体的m增加到某些特定的程度后会解聚形成分子质量较小的聚集体或单体，内部疏水基团重新暴露在表面，增加蛋白质表面疏水性。Jiang Yuqin等研究根据结果得出，1 mg/mL的SPI溶液在100 ℃和120 ℃各加热10 min，积温值为1 000 ℃·min和1 200 ℃·min，m大于400 kDa的可溶性聚集体相对含量分别为35%和10%，m为100～400 kDa的可溶性聚集体相对含量分别为35%和40%，m小于100 kDa的可溶性聚集体相对含量分别为30%和50%。

　　在热处理过程中SPI组分β-conglycinin会分解成α、α’、β亚基，glycinin会分解成A多肽和B多肽。有研究认为，在SPI系统中，如果β-conglycinin的浓度低于glycinin的浓度时，聚集类似于glycinin，由于B多肽和β亚基相对疏水，故容易形成[β-β]n、[β-β]nBm和[B-B]m（其中n和m为自然数）的聚合物；此时，相对亲水的α/α’亚基数量不足以形成排斥或位阻，就不会阻止蛋白质聚集，故当聚集到某些特定的程度时就会形成沉淀。

　　如果β-conglycinin的比例高于glycinin的比例，聚集类似于β-conglycinin。此时，相对亲水的α和α’亚基数量较多，α、α’和β亚基将有更高的几率与A多肽和B多肽形成α n β m B p α’o的可溶性聚集体（其中n、m、p和o为自然数）。具有较强亲水性的α/α’亚基会附着于这些聚集体的表面疏水位点，导致聚集体之间聚集终止，甚至由于N-连接的高甘露糖聚糖的存在，聚集体之间的斥力增加，蛋白质发生解聚反应。

　　在中性环境中，β-conglycinin是直径为9 nm左右、高度为4.4 nm左右的球状蛋白，glycinin是直径为11 nm左右、高度为7.5 nm左右的球状蛋白。Gao Jian等利用静态光散射和动态光散射技术探讨研究蛋白质颗粒尺寸变化显示，质量分数1.0%的β-conglycinin溶液和glycinin溶液分别在60、80 ℃和100 ℃加热30 min，积温值分别为1 800、2 400℃·min和3 000 ℃·min，相比较加热前样品，β-conglycinin的Rg/Rh值无显著变化，表明β-conglycinin聚集体的形状和未加热的β-conglycinin单体的形状相似；glycinin的Rg/Rh值从0.22变化到0.18、0.21和0.09，发现低于100 ℃加热30 min，Rg/Rh值无显著变化，表明glycinin形成的可溶性聚集体的形状与未加热的glycinin单体相似，而100 ℃加热30 min，Rg/Rh明显降低，意味着此时glycinin会组装成中心部位紧密而外表松散的不均匀聚集体。Xiao Jie等利用小角X射线散射（SAXS）仪和原子力显微镜（AFM）检测热处理对蛋白质形貌的影响（图6），20 μg/mL（pH 8.5）的β-conglycinin在80 ℃分别处理60 min和300 min，积温值为4 800 ℃·min和24 000 ℃·min，相比较加热前样品，蛋白质整体形态没有过大变化，从始至终保持球形形貌，聚集体的垂直高度从9.2 nm分别增加到12.6 nm和17.0 nm；对于20 μg/mL（pH 8.5）的glycinin溶液，相同的处理条件下，聚集体的垂直高度从6.7 nm分别增加到25～75 nm和100 nm，意味着glycinin会组装成类似棒状外观的聚集体。

　　Wang Jinmei等利用SAXS测定热处理过程中SPI形貌变化发现，天然SPI（10 mg/mL）的Kratky图为钟形曲线，且有峰值存在，表明天然SPI的形态为球形；在90 ℃加热20 min，积温值为1 800 ℃·min，曲线%左右，表明蛋白质部分展开，但蛋白质仍保持球形外观，如图7所示。Liu Fu等使用AFM观察到，60 mg/mL的SPI溶液中多数颗粒以圆片状平铺的形式存在，高度约为2～4 nm，宽度约为40～60 nm；95 ℃加热15 min，积温值为1 425 ℃·min，球形蛋白质颗粒转变为高度约4～6 nm、宽度50～200 nm的不均匀、不规则的聚集体颗粒，表明经热处理后，SPI随机聚集成椭圆片状或棒状形态，如图8所示。

　　随加热温度及其积温值的升高，凝胶网络蛋白含量逐渐增加，凝胶网络链的粗厚度和强度增加。Wu Chao等通过检验测试不同热处理温度条件凝胶网络蛋白含量的变化发现，180 mg/mL的glycinin（pH 7）溶液，在95 ℃和100 ℃各加热30 min，积温值分别为2 850 ℃·min和3 000 ℃·min，凝胶中网络蛋白的相对含量分别为80.2%和81.8%；在180 mg/mL的SPI（pH 7）溶液中，相同热处理条件时，凝胶网络蛋白的相对含量分别为84.9%和86.1%。

　　反之，如果热处理温度导致蛋白质聚集程度下降，凝胶强度也随之降低。王健等检测凝胶强度随热处理温度的变化发现，90 mg/mL的SPI溶液在90 ℃和95 ℃各处理10 min，积温值分别为900 ℃·min和950 ℃·min，凝胶强度分别为80.85 g和74.51 g。

　　此外，也有研究认为，当热处理温度高于蛋白质变性峰值温度时，β-conglycinin分子表面产生了更多的凝胶网络反应位点（主要是疏水位点），易形成无序的凝胶，导致凝胶G’下降。Nagano等的研究结果为，质量分数10% β-conglycinin的T 0 和变性峰值温度分别为64 ℃和70 ℃，该蛋白溶液在65、70、75 ℃和80 ℃加热120 min，积温值分别为7 800、8 400、9 000 ℃·min和9 600 ℃·min，凝胶G’分别是1 000、2 300、1 700 Pa和1 100 Pa。

　　冷却后，凝胶G’逐渐增强，可能是由于放热促进蛋白质间氢键的形成。Lakemond等研究程序升温过程中冷却阶段凝胶强度的变化，100 mg/mL（pH 7.6）的glycinin溶液在95 ℃加热30 min时，积温值为2 850 ℃·min，凝胶G’达到400 Pa左右，当温度从95 ℃以1 K/min的冷却速率冷却到20 ℃时，积温值为-3 375 ℃·min（放热），凝胶G’增加到4 500 Pa左右。

　　3.3 高于100 ℃及其积温值低于3 630 ℃·min的热处理对SPI及其组分的影响

　　当热处理温度高于100 ℃时，蛋白质疏水位点已充分暴露，若此时蛋白质进一步聚集或比表面积进一步减小，则蛋白质表面疏水性降低。Wang Jinmei等利用动态光散射和荧光探针研究不同热处理温度对蛋白质颗粒尺寸和表面疏水性的影响，0.2 mg/mL（pH 7.1）的SPI溶液在90 ℃和120 ℃分别加热20 min，积温值为1 800 ℃·min和2 400 ℃·min，相比较于加热前样品，蛋白质Rh从16.95 nm分别增加到17.60 nm和20.37 nm，蛋白质表面疏水性从269分别增加到683和502。

　　Wang Jinmei等利用SAXS观察SPI形貌变化，如图7所示，10 mg/mL的SPI悬浊液，120 ℃加热20 min，积温值为2 400 ℃·min，蛋白质Kratky图依旧显示钟形曲线，且有峰值存在，但相比较天然SPI，峰值强度下降了28%左右，该根据结果得出，120 ℃热处理后，蛋白质更舒展但仍就保持球形。与上述现象相反，Wang Jinmei等利用静态光散射和动态光散射分析Rg/Rh的变化显示，10 mg/mL（pH 6.4）SPI上清液，在120 ℃加热30 min，积温值为3 600 ℃·min，相比较加热前样品，Rg/Rh从1.650逐渐下降到0.797，表明经热处理后SPI构象从松散状态转变为硬质球体状态。高于100 ℃热处理时，水分蒸发较快，蛋白凝胶性质无法达到预设条件，因此在该温度条件下蛋白质胶凝性质研究较少。

　　pH值、氯化钠浓度、温度等是SPI生产的全部过程中蛋白质聚集程度重要的调控因素。蛋白质聚集程度是影响蛋白质功能性的主要的因素。本文综述了近年来pH值、氯化钠和温度对SPI及其组分聚集程度和胶凝特性影响的相关研究，聚焦于相互作用力、聚集体大小和凝胶强度。

　　pH值和氯化钠对蛋白质聚集程度的影响往往通过增加或降低蛋白质表面静电斥力而实现。温度主要是通过表面疏水性和/或二硫键影响蛋白质聚集程度。随pH值从9下降到3，或氯化钠浓度从低到高，蛋白质静电斥力先降低后增加，蛋白质聚集程度先增加后降低。随pH值的降低，蛋白凝胶强度逐渐增加，其原因：一是蛋白质聚集体尺寸逐渐增大，凝胶网络链粗厚度增加；二是蛋白质凝胶化温度降低，相同积温值处理条件，非网络蛋白有更多的机会转化为网络蛋白。随氯化钠浓度的升高，凝胶网络链粗厚度增加，高氯化钠浓度条件下，凝胶网络链粗厚度依旧较大，但凝胶网络链缠结点断裂，因此凝胶强度表现为先增加后降低的趋势。

　　温度主要是通过表面疏水性和/或二硫键影响蛋白质聚集程度。随热处理温度的升高，疏水基团暴露导致蛋白质表面疏水性升高，游离巯基暴露以及二硫键断裂导致蛋白质游离巯基含量增加。此时，分子间的引力飞速增加。β-conglycinin中，α、α’和β亚基通过疏水相互作用聚集，相对亲水的α和α’亚基位于聚集体外围，其携带的亲水聚糖及亲水基团会抑制其他聚集体的靠近，聚集终止。glycinin中，B多肽与A多肽可通过二硫键或疏水相互作用聚集，B多肽之间也能够最终靠疏水相互作用发生聚集，由于两种多肽中无亲水聚糖，即没办法提供抑制蛋白质聚集的屏障，蛋白质持续聚集直至沉淀。对于SPI，当β-conglycinin的含量高于glycinin时，形成类似αβBAα’的聚集体，聚集类似于β-conglycinin，有限聚集；反之，会形成β-β聚集体、β-B聚集体和B-B聚集体，聚集类似于glycinin，无限聚集直至沉淀。随热处理温度的升高，更多的变性蛋白被纳入凝胶网络，凝胶网络链粗厚度和强度增加。在凝胶冷却阶段，蛋白质间氢键的形成进一步增加了凝胶强度。

　　基于上述总结能够准确的看出，pH值、氯化钠和温度从不同的角度影响SPI聚集特性和胶凝特性，三者主要差异如下：1）pH值和氯化钠可提高蛋白质热稳定性，而温度的升高会破坏蛋白质结构；2）pH值和氯化钠主要是通过屏蔽或增加颗粒间静电斥力而影响蛋白质的聚集状态，温度主要是通过增加颗粒间疏水相互作用促使蛋白质聚集；3）pH值和氯化钠调节SPI聚集程度不受其组分β-conglycinin与glycinin比例的影响，而温度会受影响；4）pH值和温度主要通过改变凝胶网络链粗厚度和曲直度影响凝胶强度，氯化钠通过改变凝胶链粗厚度和凝胶网络连续性影响凝胶强度；5）随pH值的升高，凝胶互联网空间体积逐渐增大，凝胶持水能力逐渐增加；而随氯化钠浓度的增加，凝胶互联网空间体积逐渐减小，且凝胶网络缠结点断裂增加，凝胶持水能力逐渐下降。

　　虽然研究者从各个角度探索了pH值、氯化钠和温度对SPI及其组分聚集特性和流变特性的影响，但仍有一些问题是需要明确：1）从pH 3～4的酸性环境增加至pH 4～6的等电区环境和从pH 7～9中碱性环境降低至pH 4～6的等电区环境，对蛋白质的聚集方式应作出进一步验证，同理，氯化钠浓度增加至蛋白质表面电荷为零时与继续增加氯化钠浓度至蛋白质表面重新带有电荷，两种状态蛋白质的空间结构与蛋白质间作用方式应做出进一步探究；2）pH 3～4的环境中，蛋白质表面带正电荷，而氯化钠浓度较高时，蛋白质表面也带正电荷，应比较分析两种环境中蛋白质间的相互作用行为；3）对于60～100 ℃加热条件下形成的聚合物，在聚合物解聚后，将加热温度提升至100 ℃以上，需进一步探究蛋白质的聚集形式；4）当蛋白质聚集到某些特定的程度时会转化为不可溶性聚集体，而蛋白质的功能特性往往通过可溶部分体现，创造出聚集程度高而又保持高度溶解的蛋白质或许是扩大植物蛋白应用的有效手段。

　　本文《碱提酸沉参数影响大豆分离蛋白变性、聚集和流变特性的研究进展》来源于《食品科学》2024年45卷10期342-354页. 作者：孟昂，栾滨羽，郭波莉，张波，于文华，崔凯。DOI:10.7506/spkx0515-127。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　实习编辑：李雄；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网

　　为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活质量，北京食品科学研究院和中国食品杂志社将与陕西师范大学、新疆农业大学、浙江海洋大学、大连民族大学、西北大学于2024年10月14-15日在陕西西安共同举办“2024年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。

　　为加强企业主导的产学研深层次地融合，促进食品科研成果转化和服务地方经济产业，由全国糖酒会主办，北京食品科学研究院、中国食品杂志社和中粮会展（北京）有限公司承办的“食品科技成果交流会”将于2024年10月29-31日糖酒会期间在深圳国际会展中心举办 ，以当前食品科技发展的新趋势和食品产业高质量发展的重点科技需求为导向，针对食品产业高质量发展面临的重大科学技术问题，交流和借鉴国外经验，为广大食品科研工作者和生产者提供新的思路，指明发展方向。

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